Forex B1 Zertifiziert

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Fosforilación de la proteína. Se usó un ensayo de fosforilación acoplado para monitorizar la formación de fosfo-CheY por el complejo ternario receptor-CheW-CheA bajo condiciones en las que la fosforilación de CheA era la etapa limitante de velocidad (9). Se incubaron CheA (5 pmol), CheW (80 pmol), CheY (200pmol) y membranas que contenían el receptor en 15 l de Tris-HCl 50 mM (pH 7,5) glicerol 50 mM KCl10 (p / MM EDTA5 mM MgCl2 a temperatura ambiente durante 1 h. En algunos experimentos, también se encontraban en la mezcla 12 pmol de CheZ o 9 g de proteína de un lisado de células que contenía CheR (proporcionando una concentración CheR final de 1 a 2 M). Las reacciones se iniciaron a temperatura ambiente por adición de 5 l de -32PATP (2.000 cpm / pmol Amersham) a 0.15 mM y se detuvieron después de 10 s mediante la adición de un tampón de muestra de electroforesis que contenía EDTA. Las muestras fueron procesadas por gelelectroforesis de dodecilsulfato sódico-poliacrilamida (SDS-PAGE) (14 poliacrilamida) (33). Los geles se tiñeron brevemente, se desnaturalizaron y se secaron inmediatamente. Phospho-CheY se cuantificó con un PhosphorImager (Molecular Dynamics, Inc.). Damos las gracias a Angela Lilly para la construcción de pAL11 y nuestros colegas citados en Materiales y Métodos para las cepas bacterianas y los plásmidos. Bandas de bollinger jstock. La influencia de un quimiorreceptor en una quinasa asociada tiene dos aspectos distintos: (i) activación basal y (ii) modulación de la actividad en respuesta a cambios en la ocupación del receptor (6-8, 32). Ambos requieren la formación de un complejo ternario que consiste en un receptor, CheA, y una proteína accesoria, CheW (17, 41). Este complejo es estable a lo largo de los tiempos relevantes para la respuesta y adaptación sensorial (17). La activación basal de CheA por un receptor de interacción establece una actividad en estado estacionario de la quinasa que determina el contenido celular del regulador de respuesta fosforilado CheY (fosfo-CheY). Phospho-CheY interactúa con el interruptor flagelar para inducir la rotación en sentido de las agujas del reloj (CW) de otro motor de sentido contrario a las agujas del reloj (CCW). La activación basal apropiada establece un contenido de fosfo-CheY en una célula normal que crea un equilibrio entre la rotación flagelar CCW y CW, lo que produce una alternancia correspondiente entre natación lisa y caída. El patrón hace que una célula de natación se mueva en un paseo al azar. La modulación de la actividad quinasa a partir de su nivel de activación basal se efectúa mediante receptores que han experimentado un cambio en la ocupación del ligando pero que aún no se han adaptado. La modulación da como resultado un contenido alterado de fosfo-CheY, que cambia el equilibrio de CCW a CW y, por lo tanto, la frecuencia de caída, inclinando la banda aleatoria para dirigir la célula en una dirección favorable. Como el receptor Tar de alta abundancia, el receptor Trg de baja abundancia estimuló eficazmente la actividad quinasa de CheA y la fosforilación unida de CheY (Fig. 1 y 2) . Para los receptores de alta abundancia, se sabe que la activación de la quinasa es moderada por la formación de complejos ternarios con CheA y CheW (17, 41). La estimulación quinasa por Trg implica que este receptor de baja abundancia también forma complejos ternarios con CheA y CheW. El requisito de CheW en Trg mediada por estimulación de CheA en nuestros ensayos in vitro apoya esta implicación. La existencia de interacciones comparables con CheAand CheW para receptores de alta y baja abundancia es razonable, ya que la mayor identidad de secuencia entre los receptores está en la región implicada en la interacción con CheA y CheW (2, 26). Parece que Trg, y probablemente otros receptores de baja abundancia, interactúan físicamente con CheA y CheW para crear activación basal de la quinasa. Las bandas de Bollinger fueron inventadas Perry Kaufman y popularizado por el analista John Bollinger. Las bandas de Bollinger normalmente se dibujan. La influencia de un quimiorreceptor en una quinasa asociada tiene dos aspectos distintos: (i) activación basal y (ii) modulación de la actividad en respuesta a cambios en la ocupación del receptor (6-8, 32). Ambos requieren la formación de un complejo ternario que consiste en un receptor, CheA, y una proteína accesoria, CheW (17, 41). Este complejo es estable a lo largo de los tiempos relevantes para la respuesta y adaptación sensorial (17). La activación basal de CheA por un receptor de interacción establece una actividad en estado estacionario de la quinasa que determina el contenido celular del regulador de respuesta fosforilado CheY (fosfo-CheY). Phospho-CheY interactúa con el interruptor flagelar para inducir la rotación en sentido de las agujas del reloj (CW) de otro motor de sentido contrario a las agujas del reloj (CCW). La activación basal apropiada establece un contenido de fosfo-CheY en una célula normal que crea un equilibrio entre la rotación flagelar CCW y CW, lo que produce una alternancia correspondiente entre natación lisa y caída. El patrón hace que una célula de natación se mueva en un paseo al azar. La modulación de la actividad quinasa a partir de su nivel de activación basal se efectúa mediante receptores que han experimentado un cambio en la ocupación del ligando pero que aún no se han adaptado. La modulación da como resultado un contenido alterado de fosfo-CheY, que cambia el equilibrio de CCW a CW y, por lo tanto, la frecuencia de caída, inclinando la banda aleatoria para dirigir la célula en una dirección favorable. Purificación y cuantificación de proteínas. CheA, CheW, CheY y CheZ se produjeron en RP3098 que albergaba el plásmido apropiado y se purificó como se describe por Hess et al. (22) o Matsumura et al. (29). Los tres primeros se obtuvieron con pureza 95, y CheZ era 80 puro. Sobre 70 del CheA purificado estaba la forma larga (44). Las concentraciones de proteínas puras y de proteína en extractos celulares se determinaron mediante el Bio-Radassay utilizando albúmina de suero bovino como patrón. La proteína total en muestras de membrana se determinó mediante la modificación de Peterson del ensayo de Lowry (39), la cantidad de receptor se determinó mediante inmunoblots cuantitativos (14) en los que muestras de muestras y patrones puros de Trg o Tar estaban presentes en la misma inmunotransferencia Cuantificado con adensitómetro (Molecular Dynamics, Inc.). Si Trg y Tar activan cada uno CheA a través de la formación de complejos ternarios, ¿por qué la activación mediada por los dos receptores in vitro no es idéntica? Al menos tres factores podrían contribuir, dos relacionados con el ensayo y uno inherente a las proteínas: , (Ii) razones de modificación, y (iii) residuos no conservados. (I) Con respecto a la estabilidad proteica, Trg es más susceptible a la proteolisis que el Tar (observaciones no publicadas), lo que implica que es más propenso al despliegue parcial, tendencia que podría causar una mayor proporción de Trg en Una preparación de membrana para ser incapaz de activación de quinasa. (Ii) Con respecto a las relaciones de modificación, la activación de la quinasa por un receptor varía desde casi ninguna activación si todos los sitios que aceptan metilas transportan cadenas laterales negativas (glutamatos) hasta la activación máxima si todas llevan cadenas laterales neutras (glutaminas o glutamilmetil ésteres) 6 Fig. 3), pero no se sabe si el parámetro crucial es el número de sitios neutrales o la relación de sitios neutrales a cargados. Si la relación fuese el factor de control, Trg (3E-2Q), la forma de Trg probada en la Fig. 1 y 2, exhibirían una activación de quinasa más baja que Tar (2E-2Q), la forma de Tar a la que se comparó. (Iii) Respecto a los residuos no conservados, las secuencias de Tar y Trg difieren en varias posiciones cerca del núcleo altamente conservado. Esto podría sutilmente reducir la activación de la quinasa exhibida por Trg. Si este tercer factor fuese importante, ¿podría ser la base de la baja frecuencia de la caída y de los taxis ineficientes en las células Trg sólo? Los datos argumentan en contra de esta noción. In vitro, la tasa de producción de fosfo-CheY de Tar-activado CheA puede ser Coincidiendo con la quinasa activada por Trg por adición de dos veces más Trg (figura 1). Si esta relación se mantiene in vivo, lo que parece probable, ya que las concentraciones de receptor probadas en la Fig. 1 están dentro del rango de los estimados para existir en una célula de tipo salvaje (19), entonces el aumento de la dosis de Trg debería corregir el problema. Sin embargo, el aumento de Trgdosage en un rango de 100 veces no mejora los taxis (14). Por lo tanto, parece improbable que la modesta diferencia en kinaseactivation detectado in vitro explica las diferencias en la acción del receptor in vivo. Actividad de aceptación de metilo. Encontramos in vitro que el receptor Trg de baja abundancia era dramáticamente menos eficiente como sustrato que aceptaba metil que el receptor de alta abundancia Tar. Esta observación in vitro es paralela a numerosas observaciones in vivo. En las células que carecen de receptores de gran abundancia, la adaptación a los estímulos mediados por Trg es tan lenta que para grandes cambios temporales en la ocupación del receptor, la adaptación no ocurre ni siquiera durante largos períodos de observación (20). En Trg-sólo las células, estacionario-esta estetilación se reduce significativamente y los aumentos en la metilación después de la estimulación son sólo detectables (14, 20, 21, 35, 48). Estos defectos in vivo pueden entenderse como consecuencias directas de una baja tasa de metilación de Trg y por lo tanto implican que lo que observamos in vitro es también el caso in vivo. Una baja tasa de metilación significaría una adaptación lenta y una reducción de los niveles de metilación en estado estacionario debido a un equilibrio cambiado entre la metilación y la desmetilación. Por lo tanto, a diferencia de la cuestión de la activación de quinasa por Trg para que las observaciones in vivo implicó un resultado diferente de la encontrada por ensayos in vitro, hay una coherencia entre in vivo e in vitro las evaluaciones de metil-aceptación de la actividad de este receptor de baja abundancia. Además, nuestra caracterización de los efectos de las modificaciones adaptativas sobre la activación de la quinasa por Trg (Fig. 3) sugiere una resolución de la aparenteinconsistencia entre las observaciones sobre la activación de la quinasa in vivo e in vitro. Los datos de la Fig. 3 muestran que kinaseactivation in vitro no es una propiedad invariable de Trg, sino que es una función de la extensión de la modificación en los sitios de aceptación de metila. Los bajos niveles de metilación significan baja activación de la quinasa. Por lo tanto, para Trg-sólo las células, en el que Trg metilación está en un nivel bajo, el in vitro resulta en la Fig. 3 predecirían poca activación de la quinasa. Esto es consistente con la baja frecuencia tumble y los taxis ineficientes exhibidos por tales células. Se utilizó un ensayo de fosforilación acoplado para monitorizar la formación de fosfo-CheY por el complejo ternario receptor-CheW-CheA en condiciones bajo las cuales la fosforilación de CheA era la etapa limitante de la velocidad (9). Se incubaron CheA (5 pmol), CheW (80 pmol), CheY (200pmol) y membranas que contenían el receptor en 15 l de Tris-HCl 50 mM (pH 7,5) glicerol 50 mM KCl10 (p / MM EDTA5 mM MgCl2 a temperatura ambiente durante 1 h. En algunos experimentos, también se encontraban en la mezcla 12 pmol de CheZ o 9 g de proteína de un lisado de células que contenía CheR (proporcionando una concentración CheR final de 1 a 2 M). Las reacciones se iniciaron a temperatura ambiente por adición de 5 l de -32PATP (2.000 cpm / pmol Amersham) a 0.15 mM y se detuvieron después de 10 s mediante la adición de un tampón de muestra de electroforesis que contenía EDTA. Las muestras fueron procesadas por gelelectroforesis de dodecilsulfato sódico-poliacrilamida (SDS-PAGE) (14 poliacrilamida) (33). Los geles se tiñeron brevemente, se desnaturalizaron y se secaron inmediatamente. Phospho-CheY se cuantificó con un PhosphorImager (Molecular Dynamics, Inc.). Bandas de bollinger jstock. Actividad de aceptación de metilo. Se compararon las actividades de Trg y Tar como sustratos para la metilación in vitro. Se incubaron membranas aisladas que no contenían ningún receptor, Trg o Tar con un extracto celular enriquecido en CheR en presencia de AdoMet, y se analizaron muestras de la mezcla para metilación de carboxilo de los receptores por SDS-PAGE y cuantificación de 3Hmetanol liberado de alcali tratado Rebanadas de geles que contienen la proteína receptora. Hubo una notable diferencia en las actividades de aceptación de metilo de Trg y Tar. Como se muestra en la Fig. 4, la velocidad inicial de metilación Trg fue aproximadamente 5 del valor de Tar. La preincubación con CheA, CheW y CheY para formar complejos de señalización no alteró la diferencia en la actividad de aceptación de metilo entre los tworeceptors (datos no mostrados). Autor correspondiente. Dirección postal: Departamento de Bioquímica y Biofísica, Universidad Estatal de Washington, Pullman, WA99164-4660. Teléfono: (509) 335-2174. Fax: (509) 335-9688. E-mail: hazelbau membrane. chem. wsu. edu. Este trabajo fue apoyado por la subvención GM29963 de los Institutos Nacionales de Salud a G. L.H. Actividad de aceptación de metilo. Se compararon las actividades de Trg y Tar como sustratos para la metilación in vitro. Se incubaron membranas aisladas que no contenían ningún receptor, Trg o Tar con un extracto celular enriquecido en CheR en presencia de AdoMet, y se analizaron muestras de la mezcla para metilación de carboxilo de los receptores por SDS-PAGE y cuantificación de 3Hmetanol liberado de alcali tratado Rebanadas de geles que contienen la proteína receptora. Hubo una notable diferencia en las actividades de aceptación de metilo de Trg y Tar. Como se muestra en la Fig. 4, la velocidad inicial de metilación Trg fue aproximadamente 5 del valor de Tar. La preincubación con CheA, CheW y CheY para formar complejos de señalización no alteró la diferencia en la actividad de aceptación de metilo entre los tworeceptors (datos no mostrados). Quinasa. Nos comparamos las capacidades del receptor de baja abundancia Trg y el receptor de alta abundancia de alquitrán para estimular la actividad quinasa de CheA in vitro mediante un ensayo acoplado en el que la fosforilación de CheA fue el paso limitante para la aparición de fosfo - CheY (9). Se incubaron membranas aisladas que no contenían receptor, Trg o Tar con CheA, CheW y CheY purificados para permitir la formación de complejos, se añadió -32PATP y se midió la velocidad de producción inicial de fosfo-CheY marcado con 32P por SDS-PAGE y la formación de imágenes de fosforos. Las comparaciones cuantitativas de la activación de la quinasa por los dos tipos diferentes de receptores requirieron atención a detalles específicos de manipulaciones técnicas y diseño experimental. Encontramos que la actividad del receptor embebido en amambrana en el ensayo acoplado podría verse afectada por la edad y el historial de almacenamiento de la preparación de membrana. Por lo tanto, la comparación de las actividades de Trg y Tar requiere aislar las membranas al mismo tiempo y hacer simultáneamente manipulaciones y ensayos. Dado que el fosfo-CheY es susceptible a la hidrólisis a medida que los geles son procesados ​​y procesados ​​y las pérdidas pueden variar de gel a gel (9), colocamos las muestras para comparar en el mismo gel y determinamos mediante controles internos que las pérdidas no varían con la ubicación del gel carril. Para evaluar posibles diferencias en la activación de la quinasa, era importante ajustar las estequiometrías proteicas en la mezcla de ensayo de modo que la producción de fosfo-CheY fuera una función de la cantidad de receptor de otro modo, las diferencias entre los tipos de receptores podrían ser enmascaradas. Como se muestra en la Fig. 1, pudimos definir las condiciones de ensayo deseadas. En estas condiciones, la adición de membranas que contenían el receptor Trg de baja abundancia dio como resultado una estimulación sustancial de la actividad quinasa a un nivel por encima del detectado para quimiorreceptor sin membrana, estimulaciones similares en magnitud a la mediada por el receptor de alta abundancia Tar (Fig. 1). Como se documentó anteriormente para el alquitrán (7), la activación de la quinasa por Trg embebido en membrana fue fuertemente dependiente de la presencia de CheA y CheW (datos no presentados). Se aumentó la cantidad de receptor añadido hasta 8 M bajo las mismas condiciones de ensayo (datos no mostrados) y se observó una mayor producción de fosfo-CheY hasta aproximadamente 4 M de alquitrán o Trg. Por encima de esa concentración, la cantidad de fosfo-CheY detectada disminuyó, tal vez reflejando una reducción en el número de complejos ternarios completos como el receptor en exceso de CheW (presente a 4 M) pero no CheA (presente a 0,25 M), o tal vez reflejando la inhibición debida a Cantidades crecientes de membrana cruda. En cualquier caso, en todas las concentraciones de receptores ensayadas de 0,5 a 8 M, la activación de quinasa por Trg fue comparable pero ligeramente inferior a la activación por Tar.